電泳用SYBR Green I 使用方法
SYBR Green I預(yù)染方法
◆ 該方法適于瓊脂糖凝膠電泳和PAGE凝膠電泳
◆ 工作液的配制：用電泳緩沖液將10000×的SYBR GreenⅠ稀釋100倍，即為SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一個月以上。
◆ 制膠：按常規(guī)方法制膠，不含任何染料。
◆ 樣品染色：向分析樣品中加入SYBR GreenⅠ工作液和載樣緩沖液，室溫放置10分鐘，使SYBR GreenⅠ與樣品中DNA充分結(jié)合。SYBR GreenⅠ工作液加入量為總上樣量的1/10。
◆ DNA Marker染色：將5μL DNA Marker和5μL DNA Marker稀釋液和1μLSYBR GreenⅠ工作液混勻，室溫放置5分鐘，使SYBR GreenⅠ與DNA充分結(jié)合。
◆ 上樣、電泳：按常規(guī)操作。
SYBR Green I后染方法
◆ 按照常規(guī)方法進行電泳。
◆ 用PH 7.0 - 8.5 的緩沖液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀釋SYBR GreenⅠ濃縮液，混勻，制成染色溶液。
◆ 將染色溶液倒入合適的聚丙烯容器中，放入凝膠，用鋁箔等蓋住容器使染料避光。室溫振蕩染色10-30分鐘，染色時間因凝膠濃度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝膠直接在玻璃平皿上染色，將配好的工作溶液輕輕地倒在膠板上，讓工作液均勻地覆蓋整個膠板，并染色30分鐘。玻璃平皿必須預(yù)先經(jīng)過硅烷化溶液處理（避免染料吸附在玻璃表面上）。
◆ 用藍盾TM觀測。藍光可透過玻璃，觀測聚丙烯酰胺凝膠時，可直接將托有凝膠的玻璃平皿放入藍盾TM內(nèi)觀測。
SYBR Green I使用注意事項
◆ 在”SYBR GreenⅠ預(yù)染色方法”中，電泳時間不要超過2小時，否則SYBR GreenⅠ會從DNA上分離出來，會產(chǎn)生彌散狀條帶。
◆ 在常規(guī)用酒精沉淀核酸的過程中，SYBR Green I可以全部從雙鏈核酸上去掉。
◆ 如果想對用 SYBR Green I 染過的膠進行 Southern blots，建議在預(yù)雜化和雜化溶液中加入0.1%- 0.3% 的SDS。
◆ 在紫外照射透視下，與雙鏈 DNA 接合的 SYBR Green I 呈現(xiàn)綠色熒光。如果膠中含有單鏈 DNA 則顏色為橘黃而不是綠色。
◆ SYBR Green 對玻璃和非聚丙烯材料具有一定親合力。建議在稀釋、貯存、染色等使用過程中用聚丙烯類容器。
SYBR Green I熒光定量PCR
SYBR Green I與dsDNA 結(jié)合熒光信號可增強800-1000倍。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green I熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，熒光信號增強，而不摻入鏈中的SYBR Green I染料分子熒光不變，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。熒光可以在退火階段或者延伸階段測定。
