【產(chǎn)品名稱】 雙鏈 DNA 超敏檢測試劑盒（熒光法） 英文名稱：Qubit® dsDNA HS Assay Kits
【包裝規(guī)格】 100 人份&500 人份/盒
【用途】
常規(guī)的DNA含量的檢測方法是在260nm（A260）處測其吸光值。這種方法的主要缺點是核苷酸、單鏈核酸和蛋白質(zhì)對信號的影響很大，并且還會受到核酸制備過程中污染物的干擾，無法區(qū)分DNA和RNA，而且這種方法不靈敏（5μg/mLdsDNA溶液A260=0.1）。PicoGreen定量檢測方法簡單、方便，被多家生物制品廠所選擇，成為生物制品殘留DNA檢測的標(biāo)準(zhǔn)。目前該方法已納入2010年版《中國藥典》
例如：Nanodrop系列微量分光光度計是目前最常見的紫外吸光法檢測測樣品的濃度及純度， 由于它會檢測吸光度在260nm處所有物質(zhì)的吸光值（如DNA/RNA以及降解核酸和游離核苷酸等其他雜質(zhì)），因此讀數(shù)并不是十分準(zhǔn)確。而熒光計通過熒光染料與特定目標(biāo)分子結(jié)合后，檢測其熒光強度來測目標(biāo)分子的濃度，因此其定量結(jié)果一般低于A260nm處的讀數(shù)，但是更為準(zhǔn)確。
重要的是準(zhǔn)確的DNA定量對于后續(xù)應(yīng)用至關(guān)重要。 Nanodrop系列全波長微量分光光度計無法精確測定 5ng/ul 以下的 DNA 濃度，然而，許多 DNA 樣品又恰在這個范圍之內(nèi)，在檢測雙鏈 DNA 時，熒光計的檢測極限可達 0.5pg/ul。此時，更靈敏的熒光計似乎是個更好的選擇。 熒光計和相應(yīng)的定量試劑盒，能快速靈敏、精確測定 DNA 的濃度。
本試劑將被用于成本昂貴的下游實驗:qPCR 、PCR 克隆、轉(zhuǎn)染和新一代測序等精密測定的實驗，精準(zhǔn)定量范圍10pg /μL至10ng/μL。
【檢驗原理】
PicoGreen與DNA雙鏈結(jié)合后才發(fā)出的熒光，無DNA不發(fā)熒光；所發(fā)熒光與DNA濃度成正比。在2010年《中國藥典》中提出，PicoGreen定量DNA的方法檢出限約10pg/uL，DNA含量在10pg/uL~10ng/uL 范圍時線性較好(R2>0.99). 本試劑盒利用 Picogreen DNA 染料能夠特異性結(jié)合雙鏈 DNA，而不與蛋白質(zhì)、RNA、鹽離子結(jié) 合的原理，通過激發(fā)光照射，Qubit 檢測儀收集發(fā)射光，特異的分析樣品中雙鏈 DNA 的實際含量，能夠 排除樣品中蛋白質(zhì)、RNA、鹽離子等物質(zhì)的干擾，從而對雙鏈DNA進行精準(zhǔn)的定量。
優(yōu)點：
該方法可以測定來源于任何表達宿主樣品中的雙鏈DNA。
可以直接定量PCR擴增產(chǎn)物而無需從反應(yīng)混合物中純化DNA。
遠遠超出傳統(tǒng)紫外A260的檢測方法和Hoechst33258的靈敏度。
特異性檢測與Mg2+、氯化鈉、醋酸鈉、醋酸銨、乙醇、苯酚、氯仿、SDS、RNA、蛋白質(zhì)、Triton-X100、 dNTPS、BSA等干擾物沒有交叉反應(yīng)。
在等摩爾濃度 ssDNA 和 RNA 存在的條件下測定 dsDNA，其影響很小。
【所需器材】Qubit® assay tubes (500 tubes, Life Technologies, Cat. no. Q32856)或者 Axygen® PCR-05-C tubes(VWR, part no. 10011-830)； 熒光儀（Qubit 2.0 ，Qubit 3.0 等熒光儀）
【注意事項】
1. 檢測溫度：所有檢測必須在室溫操作(22–28?C)；
2. 孵育時間：DNA 與工作液混合后，反應(yīng) 3min，熒光信號在 3 個小時內(nèi)都是穩(wěn)定的。
3. 熒光校準(zhǔn)：每次使用前，請按照批次使用校準(zhǔn)，以確保實時檢測數(shù)據(jù)的一致性。
【試劑盒組份】
|
Components |
100assays |
500 assays |
Concentration |
Storage |
|
Qubit dsDNA HS Reagent (Component A) |
50μL |
0.25mL |
200X in DMSO |
4oC Protect from light 12months |
|
dsDNA HS Buffer (Component B) |
10mL |
50mL |
TE Buffer |
|
|
dsDNA HS Standard#1 (Using Component B) |
N/A |
N/A |
0 ng/uL in TE Buffer |
|
|
dsDNA HS Standard#2(Component C) |
0.2mL |
1mL |
10 ng/uL in TE Buffer |
*備注：不同批次的試劑不可混合使用：
【檢驗方法】
1. 實驗準(zhǔn)備：
1）在使用前，將試劑盒中的各組分恢復(fù)至室溫。
2）準(zhǔn)備足夠量 0.5 mL PCR 薄壁管并標(biāo)注。請勿在 PCR 管側(cè)壁標(biāo)注，以免影響熒光信號采集。推薦使用 Qubit® assay tubes（Cat. No. Q32856）或 Axygen® PCR-05-C tubes（Cat. No. 10011-830）。
2. 配制檢測工作液
在塑料容器中，使用 dsDNA Buffer 按比例將適量dsDNA Reagent 稀釋至1×（例：取1 μL dsDNA Reagent，加入 199 μL dsDNA Buffer），現(xiàn)用現(xiàn)配。工作液配制好后，3小時內(nèi)使用。
3. 配制待檢樣品
1）配制待檢標(biāo)準(zhǔn)品。取 190 μL 檢測工作液至標(biāo)準(zhǔn)品 PCR 管中，分別加入 10 μL dsDNA Standard 1 和 dsDNA Standard 2 至相 應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品 PCR 管中，輕輕渦旋振蕩 2-3 sec，盡量避免氣泡產(chǎn)生。
2）配制待檢樣品。取 180-199 μL 檢測工作液至樣本 PCR 管中，分別加入 1-20 μL 待檢樣本，使 PCR 管中每個樣本終體積 為 200 μL，輕輕渦旋振蕩 2-3 sec，盡量避免氣泡產(chǎn)生。
4. 檢測
1）將所有待檢 PCR 管置于室溫避光孵育 2 min。
2）按照 Qubit®熒光儀的操作說明，選擇 dsDNA High Sensitivity 檢測程序測定熒光信號值。
【操作流程圖例】
2. Qubit® 3.0 操作步驟
2.1 在 Qubit® 3.0 主屏幕操作頁面，選擇 DNA，然后選擇檢測類型 dsDNA High Sensitivity。顯示“Read standards”，選擇 Read Standards 進行檢測。
2.2 將裝有 Standard #1 管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #1。
2.3 將 裝有 Standard #2 管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #2。
2.4 按鍵 Run samples。
2.5 在讀取頁面，選擇相應(yīng)的單位和體積；
2.5.1 從旋轉(zhuǎn)輪面板上選擇+或-按鈕來選擇添加到試管中的樣品體積（從1 - 20μl）；
2.5.2 從下拉菜單中選擇測量樣品濃度的濃度單位。
2.6 將裝有待測樣品的管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read ，讀取完成后(~3 seconds), 移走樣品， 直至樣品測完。
3. Qubit® 2.0 操作步驟
3.1 在 Qubit® 2.0 主屏幕操作頁面，選擇 DNA，然后選擇檢測類型 dsDNA High Sensitivity。顯示“Read standards”，
選擇 Read Standards 進行檢測。
3.2 將裝有 Standard #1 的管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋，按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #1。
3.3 將 裝有 Standard #2 管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read standard. 讀取完成后(~3 seconds)， 移走 Standard #2。
3.4 按鍵 Run samples。
3.5 將裝有待測樣品的管子插入樣品槽中，關(guān)閉上蓋， 按鍵 Read，讀取完成后(~3 seconds),移走樣品，直至樣品測完。
3.6 按照200/X公式計算管中DNA濃度。
樣品濃度 = QF value ×（ QF Value :Qubit® 2.0 直接測量得到樣品的結(jié)果；X:加入的樣品的體積）
污染物對 dsDNA 定量檢測試劑盒檢測結(jié)果的影響
Effect of contaminants in the Qubit ® dsDNA HS Assay, tested over a range of 1–500 ng/mL
|
污染物 Contaminant |
10 μL 樣品中的濃度 Concentration in10 μL Sample |
樣品檢測時濃度 Final Concentration in the assay |
檢測結(jié)果 Result |
|
Salts |
|||
|
Ammonium acetate |
200 mM |
10 mM |
OK |
|
Sodium acetate |
200 mM |
10 mM |
OK |
|
Sodium chloride |
200 mM |
10 mM |
OK |
|
Magnesium chloride |
40 mM |
2 mM |
OK |
|
Organic Solvents |
|||
|
Phenol |
2% |
0.1% |
OK |
|
Ethanol |
20% |
1% |
OK |
|
Chloroform |
4% |
0.2% |
OK |
|
Detergents |
|||
|
Sodium dodecyl sulfate |
0.2% |
0.01% |
OK |
|
Triton X-100 |
0.02% |
0.001% |
OK |
|
Other Compounds |
|||
|
Bovine serum albumin |
400 μg/mL |
20 μg/mL |
OK |
|
RNA |
1×* |
1×* |
OK |
|
dNTPs |
2 mM |
100 μM |
OK |
|
Polyethylene glycol |
20% |
1% |
OK |
|
Agarose |
2% |
0.1% |
OK |
*1×：表示含有與 dsDNA 相同濃度的 RNA。
